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In den letzten zehn Jahren hat die Gensequenzierungstechnologie breite Anwendung in der Krebsforschung und klinischen Praxis gefunden und sich zu einem wichtigen Instrument zur Aufklärung der molekularen Eigenschaften von Krebs entwickelt. Fortschritte in der Molekulardiagnostik und der zielgerichteten Therapie haben die Entwicklung von Konzepten für die Tumorpräzisionstherapie gefördert und die gesamte Tumordiagnostik und -behandlung grundlegend verändert. Genetische Tests können zur Krebsvorsorge, zur Unterstützung von Behandlungsentscheidungen und zur Prognosebewertung eingesetzt werden und sind ein wichtiges Instrument zur Verbesserung der klinischen Ergebnisse. Hier fassen wir die neuesten Artikel in CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol und anderen Fachzeitschriften zusammen, um die Anwendung genetischer Tests in der Krebsdiagnostik und -behandlung zu untersuchen.

Somatische Mutationen und Keimbahnmutationen. Krebs wird im Allgemeinen durch DNA-Mutationen verursacht, die von den Eltern vererbt (Keimbahnmutationen) oder mit dem Alter erworben (somatische Mutationen) werden können. Keimbahnmutationen sind von Geburt an vorhanden, und der Mutator trägt die Mutation normalerweise in der DNA jeder Körperzelle und kann an die Nachkommen weitergegeben werden. Somatische Mutationen werden von Individuen in nicht-gametischen Zellen erworben und normalerweise nicht an die Nachkommen weitergegeben. Sowohl Keimbahn- als auch somatische Mutationen können die normale funktionelle Aktivität von Zellen zerstören und zu einer malignen Entartung von Zellen führen. Somatische Mutationen sind ein Haupttreiber von Malignität und der aussagekräftigste Biomarker in der Onkologie. Etwa 10 bis 20 Prozent der Tumorpatienten tragen jedoch Keimbahnmutationen, die ihr Krebsrisiko signifikant erhöhen, und einige dieser Mutationen sind auch therapeutisch.
Treibermutation und Passagiermutation. Nicht alle DNA-Varianten beeinflussen die Zellfunktion; im Durchschnitt sind fünf bis zehn genomische Ereignisse, sogenannte „Treibermutationen“, erforderlich, um eine normale Zelldegeneration auszulösen. Treibermutationen treten häufig in Genen auf, die eng mit Zellaktivitäten verbunden sind, wie z. B. Genen, die an der Regulierung des Zellwachstums, der DNA-Reparatur, der Zellzykluskontrolle und anderen Lebensprozessen beteiligt sind, und könnten als therapeutische Angriffspunkte genutzt werden. Die Gesamtzahl der Mutationen bei jeder Krebsart ist jedoch recht hoch und reicht von einigen Tausend bei manchen Brustkrebsarten bis zu über 100.000 bei einigen hochvariablen Dickdarm- und Gebärmutterkrebsarten. Die meisten Mutationen haben keine oder nur eine begrenzte biologische Bedeutung, selbst wenn die Mutation in der kodierenden Region auftritt. Solche unbedeutenden Mutationsereignisse werden als „Passagiermutationen“ bezeichnet. Wenn eine Genvariante in einem bestimmten Tumortyp dessen Ansprechen auf oder Resistenz gegen eine Behandlung vorhersagt, gilt die Variante als klinisch operabel.
Onkogene und Tumorsuppressorgene. Gene, die bei Krebs häufig mutieren, lassen sich grob in zwei Kategorien einteilen: Onkogene und Tumorsuppressorgene. In normalen Zellen fördert das von Onkogenen kodierte Protein hauptsächlich die Zellproliferation und hemmt die Zellapoptose, während das von Oncosuppressorgenen kodierte Protein hauptsächlich für die negative Regulierung der Zellteilung verantwortlich ist, um die normale Zellfunktion aufrechtzuerhalten. Im malignen Transformationsprozess führt eine genomische Mutation zu einer verstärkten Onkogenaktivität und einer verminderten oder verlorenen Aktivität der Oncosuppressorgene.
Kleine Variation und strukturelle Variation. Dies sind die beiden Haupttypen von Mutationen im Genom. Kleine Varianten verändern die DNA, indem sie eine kleine Anzahl von Basen ändern, löschen oder hinzufügen, darunter Baseninsertion, Deletion, Frameshift, Startcodon-Verlust, Stopcodon-Verlust-Mutationen usw. Strukturelle Variation ist eine große Umlagerung des Genoms, die Gensegmente in der Größe von einigen tausend Basen bis zum größten Teil des Chromosoms betrifft, darunter Änderungen der Genkopienzahl, Chromosomendeletion, -duplikation, -inversion oder -translokation. Diese Mutationen können eine Verringerung oder Verbesserung der Proteinfunktion verursachen. Neben Veränderungen auf der Ebene einzelner Gene sind auch genomische Signaturen Teil klinischer Sequenzierungsberichte. Genomische Signaturen können als komplexe Muster kleiner und/oder struktureller Variationen betrachtet werden, darunter Tumormutationslast (TMB), Mikrosatelliteninstabilität (MSI) und homologe Rekombinationsdefekte.

Klonale und subklonale Mutationen. Klonale Mutationen kommen in allen Tumorzellen vor, sind bei der Diagnose vorhanden und bleiben auch nach Fortschreiten der Behandlung bestehen. Daher können klonale Mutationen als therapeutische Angriffspunkte für Tumoren genutzt werden. Subklonale Mutationen kommen nur in einer Untergruppe von Krebszellen vor und können zu Beginn der Diagnose erkannt werden, verschwinden aber bei einem späteren Rückfall oder treten erst nach der Behandlung auf. Unter Krebsheterogenität versteht man das Vorhandensein mehrerer subklonaler Mutationen in einer einzigen Krebserkrankung. Bemerkenswerterweise handelt es sich bei der überwiegenden Mehrheit der klinisch bedeutsamen Treibermutationen in allen gängigen Krebsarten um klonale Mutationen, die während des gesamten Krebsverlaufs stabil bleiben. Resistenzen, die oft durch Subklone vermittelt werden, sind zum Zeitpunkt der Diagnose möglicherweise nicht erkennbar, treten aber erst nach der Behandlung auf, wenn die Krankheit wiederkehrt.

Die traditionelle FISH-Methode (Zellkaryotypisierung) dient der Erkennung von Veränderungen auf Chromosomenebene. FISH kann zur Erkennung von Genfusionen, -deletionen und -amplifikationen eingesetzt werden und gilt als „Goldstandard“ für die Erkennung solcher Varianten. Die Methode bietet hohe Genauigkeit und Sensitivität, hat jedoch einen begrenzten Durchsatz. Bei einigen hämatologischen Malignomen, insbesondere bei akuter Leukämie, wird die Karyotypisierung noch immer zur Diagnose und Prognose herangezogen, wird jedoch zunehmend durch gezielte molekulare Tests wie FISH, WGS und NGS ersetzt.
Veränderungen in einzelnen Genen können mittels PCR nachgewiesen werden, sowohl mittels Echtzeit-PCR als auch mittels digitaler Drop-PCR. Diese Techniken weisen eine hohe Sensitivität auf, eignen sich besonders für die Erkennung und Überwachung kleiner Restläsionen und können in relativ kurzer Zeit Ergebnisse liefern. Der Nachteil besteht darin, dass der Nachweisbereich begrenzt ist (normalerweise werden nur Mutationen in einem oder wenigen Genen erkannt) und die Möglichkeit, mehrere Tests durchzuführen, eingeschränkt ist.
Die Immunhistochemie (IHC) ist ein proteinbasiertes Monitoring-Tool, das häufig zum Nachweis der Expression von Biomarkern wie ERBB2 (HER2) und Östrogenrezeptoren eingesetzt wird. Darüber hinaus können mit der IHC auch spezifische mutierte Proteine ​​(wie BRAF V600E) und spezifische Genfusionen (wie ALK-Fusionen) nachgewiesen werden. Der Vorteil der IHC liegt in der einfachen Integration in die routinemäßige Gewebeanalyse und der damit verbundenen Kombination mit anderen Tests. Darüber hinaus kann die IHC Informationen zur subzellulären Proteinlokalisierung liefern. Nachteile sind die eingeschränkte Skalierbarkeit und der hohe organisatorische Aufwand.
Sequenzierung der zweiten Generation (NGS) NGS nutzt parallele Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken, um Variationen auf DNA- und/oder RNA-Ebene zu erkennen. Mit dieser Technik können sowohl das gesamte Genom (WGS) als auch die relevanten Genregionen sequenziert werden. WGS liefert die umfassendsten Informationen über genomische Mutationen, steht seiner klinischen Anwendung jedoch mit vielen Hindernissen gegenüber, darunter der Bedarf an frischen Tumorgewebeproben (WGS ist noch nicht für die Analyse formalinimmobilisierter Proben geeignet) und die hohen Kosten.
Die gezielte NGS-Sequenzierung umfasst die Sequenzierung vollständiger Exone und eines Zielgen-Panels. Diese Tests reichern Regionen von Interesse durch DNA-Sonden oder PCR-Amplifikation an und begrenzen so den erforderlichen Sequenzierungsaufwand (das vollständige Exom macht 1 bis 2 Prozent des Genoms aus, und selbst große Panels mit 500 Genen machen nur 0,1 Prozent des Genoms aus). Obwohl die Sequenzierung vollständiger Exone in formalinfixierten Geweben gut funktioniert, bleiben ihre Kosten hoch. Zielgenkombinationen sind relativ kostengünstig und ermöglichen eine flexible Auswahl der zu testenden Gene. Darüber hinaus entwickelt sich zirkulierende freie DNA (cfDNA) zu einer neuen Option für die Genomanalyse von Krebspatienten, die als Flüssigbiopsien bezeichnet wird. Sowohl Krebszellen als auch normale Zellen können DNA in den Blutkreislauf freisetzen. Die von Krebszellen abgegebene DNA wird als zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) bezeichnet und kann analysiert werden, um potenzielle Mutationen in Tumorzellen zu erkennen.
Die Wahl des Tests hängt vom jeweiligen klinischen Problem ab. Die meisten Biomarker zugelassener Therapien lassen sich mittels FISH, IHC und PCR nachweisen. Diese Methoden eignen sich zwar für den Nachweis geringer Mengen an Biomarkern, verbessern aber die Nachweiseffizienz bei steigendem Durchsatz nicht. Werden zu viele Biomarker nachgewiesen, reicht möglicherweise nicht mehr das zu untersuchende Gewebe aus. Bei bestimmten Krebsarten, wie z. B. Lungenkrebs, bei denen Gewebeproben schwer zu gewinnen sind und mehrere Biomarker getestet werden müssen, ist NGS die bessere Wahl. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Wahl des Tests von der Anzahl der pro Patient zu testenden Biomarker und der Anzahl der Patienten abhängt, die auf den Biomarker getestet werden sollen. In manchen Fällen ist IHC/FISH ausreichend, insbesondere wenn das Zielmolekül bereits identifiziert wurde, wie z. B. beim Nachweis von Östrogenrezeptoren, Progesteronrezeptoren und ERBB2 bei Brustkrebspatientinnen. Ist eine umfassendere Untersuchung genomischer Mutationen und die Suche nach potenziellen therapeutischen Zielmolekülen erforderlich, ist NGS übersichtlicher und kostengünstiger. Darüber hinaus kann NGS in Fällen in Betracht gezogen werden, in denen die IHC/FISH-Ergebnisse mehrdeutig oder nicht schlüssig sind.

Verschiedene Richtlinien geben Hinweise darauf, welche Patienten für genetische Tests in Frage kommen. Im Jahr 2020 veröffentlichte die ESMO Precision Medicine Working Group die ersten NGS-Testempfehlungen für Patienten mit fortgeschrittenem Krebs und empfahl routinemäßige NGS-Tests für fortgeschrittenen nicht-plattenepithelialen nicht-kleinzelligen Lungenkrebs, Prostatakrebs, Dickdarmkrebs, Gallengangskrebs und Eierstockkrebs. Im Jahr 2024 aktualisierte die ESMO diese Empfehlungen auf dieser Grundlage und empfahl die Einbeziehung von Brustkrebs und seltenen Tumoren wie gastrointestinalen Stromatumoren, Sarkomen, Schilddrüsenkrebs und Krebserkrankungen unbekannter Herkunft.
Im Jahr 2022 heißt es in der klinischen Stellungnahme der ASCO zu somatischen Genomtests bei Patienten mit metastasiertem oder fortgeschrittenem Krebs, dass bei Zulassung einer Biomarker-basierten Therapie für Patienten mit metastasiertem oder fortgeschrittenem solidem Tumor eine genetische Untersuchung empfohlen wird. Beispielsweise sollte bei Patienten mit metastasiertem Melanom ein Genomtest durchgeführt werden, um auf BRAF-V600E-Mutationen zu screenen, da RAF- und MEK-Inhibitoren für diese Indikation zugelassen sind. Darüber hinaus sollte ein genetischer Test auch durchgeführt werden, wenn ein klarer Marker für eine Resistenz gegen das dem Patienten zu verabreichende Medikament vorliegt. Egfrmab beispielsweise ist bei KRAS-mutiertem kolorektalem Krebs unwirksam. Bei der Beurteilung der Eignung eines Patienten für eine Gensequenzierung sollten der körperliche Zustand, Komorbiditäten und das Tumorstadium des Patienten berücksichtigt werden, da die für die Genomsequenzierung erforderlichen Schritte, einschließlich der Einwilligung des Patienten, der Laborverarbeitung und der Analyse der Sequenzierungsergebnisse, eine ausreichende körperliche Leistungsfähigkeit und Lebenserwartung des Patienten voraussetzen.
Neben somatischen Mutationen sollten einige Krebsarten auch auf Keimbahngene getestet werden. Tests auf Keimbahnmutationen können Behandlungsentscheidungen für Krebsarten wie BRCA1- und BRCA2-Mutationen bei Brust-, Eierstock-, Prostata- und Bauchspeicheldrüsenkrebs beeinflussen. Keimbahnmutationen können auch Auswirkungen auf zukünftige Krebsvorsorgeuntersuchungen und -prävention bei Patienten haben. Patienten, die potenziell für einen Test auf Keimbahnmutationen geeignet sind, müssen bestimmte Bedingungen erfüllen, darunter Faktoren wie Krebs in der Familie, Alter bei Diagnose und Krebsart. Viele Patienten (bis zu 50 %) mit pathogenen Mutationen in der Keimbahn erfüllen jedoch nicht die traditionellen Kriterien für einen Test auf Keimbahnmutationen aufgrund der Familienanamnese. Um die Identifizierung von Mutationsträgern zu maximieren, empfiehlt das National Comprehensive Cancer Network (NCCN), dass alle oder die meisten Patienten mit Brust-, Eierstock-, Endometrium-, Bauchspeicheldrüsen-, Dickdarm- oder Prostatakrebs auf Keimbahnmutationen getestet werden.
Da die überwiegende Mehrheit der klinisch bedeutsamen Treibermutationen klonal und im Verlauf der Krebsprogression relativ stabil ist, ist es hinsichtlich des Zeitpunkts genetischer Tests sinnvoll, Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose einer fortgeschrittenen Krebserkrankung genetisch zu testen. Für nachfolgende genetische Tests, insbesondere nach einer molekular zielgerichteten Therapie, ist die ctDNA-Analyse vorteilhafter als die DNA-Analyse aus Tumorgewebe, da Blut-DNA DNA aus allen Tumorläsionen enthalten kann und so besser Informationen über die Tumorheterogenität gewonnen werden können.
Die Analyse von ctDNA nach der Behandlung kann möglicherweise das Ansprechen des Tumors auf die Behandlung vorhersagen und den Krankheitsverlauf früher erkennen als herkömmliche bildgebende Verfahren. Es gibt jedoch keine etablierten Protokolle für die Verwendung dieser Daten zur Unterstützung von Behandlungsentscheidungen, und die ctDNA-Analyse wird nur im Rahmen klinischer Studien empfohlen. ctDNA kann auch zur Beurteilung kleiner Restläsionen nach radikaler Tumoroperation verwendet werden. ctDNA-Tests nach der Operation sind ein starker Prädiktor für den weiteren Krankheitsverlauf und können dazu beitragen, festzustellen, ob ein Patient von einer adjuvanten Chemotherapie profitiert. Es wird jedoch weiterhin nicht empfohlen, ctDNA außerhalb klinischer Studien zur Entscheidungsfindung bezüglich einer adjuvanten Chemotherapie zu verwenden.

Datenverarbeitung Der erste Schritt der Genomsequenzierung besteht darin, DNA aus Patientenproben zu extrahieren, Bibliotheken vorzubereiten und Rohsequenzierungsdaten zu generieren. Die Rohdaten müssen weiter verarbeitet werden, darunter das Filtern von Daten geringer Qualität, der Vergleich mit dem Referenzgenom, die Identifizierung verschiedener Mutationstypen mithilfe verschiedener Analysealgorithmen, die Bestimmung der Auswirkungen dieser Mutationen auf die Proteintranslation und das Filtern von Keimbahnmutationen.
Die Annotation von Treibergenen dient der Unterscheidung zwischen Treiber- und Passagiermutationen. Treibermutationen führen zum Verlust oder zur Verstärkung der Aktivität von Tumorsuppressorgenen. Kleine Varianten, die zur Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen führen, sind Nonsense-Mutationen, Frameshift-Mutationen und Schlüsselmutationen an der Spleißstelle sowie seltenere Startcodon-Deletionen, Stopcodon-Deletionen und eine Vielzahl von Intron-Insertions-/Deletionsmutationen. Auch Missense-Mutationen und kleine Intron-Insertions-/Deletionsmutationen können zum Verlust der Tumorsuppressorgenaktivität führen, wenn sie wichtige Funktionsbereiche betreffen. Strukturelle Varianten, die zum Verlust der Tumorsuppressorgenaktivität führen, sind partielle oder vollständige Gendeletionen und andere genomische Varianten, die zur Zerstörung des Gen-Leserahmens führen. Kleine Varianten, die zu einer verstärkten Funktion von Onkogenen führen, sind Missense-Mutationen und gelegentliche Intron-Insertionen/Deletionen, die wichtige funktionelle Proteinbereiche betreffen. In seltenen Fällen können Proteinverkürzungen oder Mutationen an der Spleißstelle zur Aktivierung von Onkogenen führen. Zu den strukturellen Variationen, die zur Aktivierung von Onkogenen führen, gehören Genfusion, Gendeletion und Genduplikation.
Die klinische Interpretation genomischer Variationen dient der Beurteilung der klinischen Bedeutung identifizierter Mutationen, d. h. ihres potenziellen diagnostischen, prognostischen oder therapeutischen Werts. Es gibt mehrere evidenzbasierte Bewertungssysteme, die zur klinischen Interpretation genomischer Variationen herangezogen werden können.
Die Precision Medicine Oncology Database (OncoKB) des Memorial Sloan-Kettering Cancer Center unterteilt Genvarianten anhand ihres prädiktiven Werts für die Medikamenteneinnahme in vier Stufen: Stufe 1/2: FDA-zugelassene oder klinisch standardisierte Biomarker, die das Ansprechen auf ein zugelassenes Medikament bei einer bestimmten Indikation vorhersagen; Stufe 3: FDA-zugelassene oder nicht-FDA-zugelassene Biomarker, die das Ansprechen auf neuartige zielgerichtete Medikamente vorhersagen, die in klinischen Studien vielversprechende Ergebnisse gezeigt haben; und Stufe 4: nicht-FDA-zugelassene Biomarker, die das Ansprechen auf neuartige zielgerichtete Medikamente vorhersagen, die in klinischen Studien überzeugende biologische Ergebnisse gezeigt haben. Eine fünfte Untergruppe, die mit Behandlungsresistenz assoziiert ist, wurde hinzugefügt.
Die Leitlinien der American Society for Molecular Pathology (AMP)/American Society of Clinical Oncology (ASCO)/College of American Pathologists (CAP) zur Interpretation somatischer Variationen unterteilen diese in vier Kategorien: Grad I mit hoher klinischer Bedeutung; Grad II mit potenzieller klinischer Bedeutung; Grad III mit unbekannter klinischer Bedeutung; Grad IV mit nicht bekannter klinischer Bedeutung. Nur Varianten der Grade I und II sind für Behandlungsentscheidungen relevant.
Die Molecular Target Clinical Operability Scale (ESCAT) der ESMO klassifiziert Genvarianten in sechs Stufen: Stufe I, für den Routineeinsatz geeignete Ziele; Phase II, ein Ziel, das noch untersucht wird, wird wahrscheinlich verwendet, um die Patientenpopulation zu screenen, die von dem Zielmedikament profitieren könnte, aber es sind mehr Daten erforderlich, um dies zu untermauern. Grad III, anvisierte Genvarianten, die einen klinischen Nutzen bei anderen Krebsarten gezeigt haben; Grad IV, nur anvisierte Genvarianten, die durch präklinische Beweise gestützt werden; In Grad V gibt es Beweise, die die klinische Bedeutung der gezielten Behandlung der Mutation unterstützen, aber eine Einzelmedikamenttherapie gegen das Ziel verlängert das Überleben nicht oder es kann eine kombinierte Behandlungsstrategie angewendet werden; Grad X, fehlender klinischer Wert.